一、技術(shù)簡介

CUT&TAG是一種基于抗體引導(dǎo)的靶向染色質(zhì)切割與標(biāo)簽化的高靈敏度表觀基因組分析技術(shù)，該技術(shù)克服了傳統(tǒng)ChIP-seq的 低靈敏度、高背景噪音、樣本需求量大等瓶頸，可在單細(xì)胞水平解析組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等染色質(zhì)特征，成為表觀遺傳學(xué)研究的新方向。

二、技術(shù)原理

CUT&TAG通過 四步關(guān)鍵反應(yīng) 實現(xiàn)精準(zhǔn)染色質(zhì)分析：

1. 抗體靶向定位：特異性一抗（如H3K4me3抗體）結(jié)合目標(biāo)染色質(zhì)區(qū)域，Protein A/G二抗攜帶Tn5轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物（含測序接頭）。

2. 靶向切割與標(biāo)簽化：Tn5轉(zhuǎn)座酶在抗體指引下，對目標(biāo)染色質(zhì)進(jìn)行 DNA雙鏈切割與接頭連接，切割范圍：目標(biāo)位點兩側(cè)各約50-300 bp。

3. DNA片段釋放：蛋白酶K消化染色質(zhì)交聯(lián)，釋放帶接頭的DNA片段。

4. 文庫構(gòu)建與測序：PCR擴增目標(biāo)片段，構(gòu)建Illumina測序文庫，測序深度：~20 million reads/sample（比ChIP-seq減少50%）。

三、應(yīng)用場景

CUT&TAG在單細(xì)胞水平揭示腫瘤微環(huán)境中不同亞群的表觀遺傳差異。

例如：

1.三陰性乳腺癌：通過單細(xì)胞CUT&TAG發(fā)現(xiàn)FOXA1調(diào)控的超級增強子在基底樣亞型中特異性激活，這些增強子驅(qū)動了EMT（上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化）關(guān)鍵基因（如SNAI1）表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

2.急性髓系白血?。鹤粉檹?fù)發(fā)患者骨髓樣本，鑒定出CD34+干細(xì)胞中H3K4me1修飾的動態(tài)變化，這些變化預(yù)示化療耐藥性的產(chǎn)生，為表觀靶向治療提供新靶點。

3.胚胎發(fā)育表觀重編程：CUT&TAG可追蹤早期胚胎發(fā)育中組蛋白修飾的動態(tài)建立過程。

4.小鼠著床前胚胎：發(fā)現(xiàn)H3K9me3在2-cell階段開始沉積，優(yōu)先標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)域（如LINE-1），這種修飾通過抑制轉(zhuǎn)座子活性維持基因組穩(wěn)定性。

5.人類胚胎干細(xì)胞：繪制H3K27ac在神經(jīng)分化中的動態(tài)圖譜，定位SOX2和OCT4調(diào)控的增強子網(wǎng)絡(luò)，揭示多能性退出關(guān)鍵節(jié)點。

6.免疫細(xì)胞功能調(diào)控：解析T細(xì)胞分化與功能狀態(tài)的表觀基礎(chǔ)。

7.T細(xì)胞耗竭：在慢性病毒感染模型中，發(fā)現(xiàn)耗竭性CD8+ T細(xì)胞的H3K27ac在PD-1和TIM-3基因座異常富集，這些增強子活性受TOX轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控。

8.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）：聯(lián)合ATAC-seq揭示FOXP3通過重塑H3K4me3修飾，穩(wěn)定Treg細(xì)胞的抑制性功能，該過程依賴EZH2介導(dǎo)的H3K27me3協(xié)同抑制。

四、技術(shù)優(yōu)勢

1.較高靈敏度（100細(xì)胞級檢測）：Tn5轉(zhuǎn)座酶直接在目標(biāo)位點切割并連接測序接頭，避免ChIP-seq中DNA片段化（超聲破碎）造成的隨機損失。與ChIP-seq相比，CUT&TAG的信噪比提升8倍（S/N=12:1 vs 1.5:1），檢測到的差異峰數(shù)量增加40%。

2.單堿基分辨率與精準(zhǔn)定位：抗體-Tn5復(fù)合物僅切割結(jié)合位點附近DNA（±50 bp），而ChIP-seq的超聲破碎產(chǎn)生200-500 bp隨機片段。在p53結(jié)合位點分析中，CUT&TAG檢測到單個狹窄峰（峰寬≈30 bp），而ChIP-seq呈現(xiàn)寬峰（峰寬≈200 bp），前者可精確定位到TTGCCT基序中心。

3.單細(xì)胞與空間表觀組學(xué)兼容性：聯(lián)合10x Genomics平臺，通過微流控將單個細(xì)胞與抗體-Tn5復(fù)合物包裹在油滴中，已實現(xiàn)單細(xì)胞H3K27ac圖譜構(gòu)建（Nature Methods, 2022）。

4.新開發(fā)的Spatial CUT&Tag技術(shù)可在組織切片上定位H3K4me3的亞結(jié)構(gòu)分布，例如在小鼠腦切片中可視化海馬區(qū)神經(jīng)元活性相關(guān)修飾。

五、樣本類型

新鮮細(xì)胞（貼壁細(xì)胞/懸浮細(xì)胞）、凍存細(xì)胞、凍存組織。

六、樣本需求

細(xì)胞樣本：約10,0000個（可以是24孔板的1孔，或以懸浮細(xì)胞形式存儲于離心管中）；

凍存組織：約10-20mg。

七、樣本準(zhǔn)備&運輸

活細(xì)胞樣本：距離較近的可提供新鮮樣本，將培養(yǎng)在皿/離心管內(nèi)的新鮮細(xì)胞樣本常溫快遞（最遲次日達(dá)）運輸，本市內(nèi)可閃送或親自遞送；距離較遠(yuǎn)的，可-80℃凍存細(xì)胞干冰運輸；

組織樣本：-80℃凍存干冰運輸。

八、需提供的試劑

ChIP級抗體（沒有時也可以選擇IF級抗體）

九、實驗周期

1-2周（不包含測序）

十、其他

后續(xù)檢測Rrealtime PCR/測序